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非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒操作步驟
時間:2019-03-01 點擊次數:5717

非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒操作步驟

  獸用

【獸藥名稱】

通用名稱:非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒

漢語拼音:Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名稱:African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名稱:無

【主要成分與含量】

 

【作用與用途】  用于血液、血球粉、淋巴結、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。

【用法與判定】

1 用法

1.1 樣品處理

血液樣品直接用;淋巴結、脾臟、扁桃體樣品,用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充分研磨,再加10.0 mL PBSpH 7.2,含1萬單位青霉素和1萬單位鏈霉素)用MixMax漩渦振蕩器混勻(樣品不足2.0 g1:5比例加PBS),對處理的待檢樣品置70℃,30分鐘滅活后,3 000 r/min,4 ℃離心5分鐘,取上清液,編號備用;血球粉處理同上,只不過省掉研磨步驟。

1.2 樣品存放

采集或處理好的樣品在2℃~8℃條件下保存應不超過24 h;若需長期保存,須放置-80 ℃冰箱,但應避免反復凍融(凍融不超過3次)。

1.3 操作步驟

1.3.1 病毒DNA的提?。ㄊ褂?/span>A盒)

1)待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示,取n個滅菌的1.5 mL離心管,逐管編號。

2)每管加入Buffer A 500 mL。

3)每管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對照、陰性對照各200 mL,充分混勻,室溫放置10分鐘。

4)取與上述離心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管,編號。將離心管中的溶液轉移至DNase-Free吸附柱,(為避免堵塞吸附柱,盡量不要吸懸浮雜質)。

5)用TH-15高速離心機設置13000 r/min室溫離心30秒。

6)棄去收集管液體,將吸附柱放回收集管中。

7)吸附柱內加入600 μL Buffer B,13000 r/min離心30秒。

8)棄去收集管液體,將吸附柱放回收集管中。

9)重復步驟(7),(8)。

1013000 r/min空柱離心2分鐘,去除殘留液。

11)將每個吸附柱分別移入新的1.5mL離心管中,向柱中央加入50 μL Buffer C,室溫靜置1分鐘,13000 r/min離心30秒,離心管中液體即為模板DNA。獲得的DNA溶液,冰上保存備用(注意提取的DNA須在2 h內進行PCR 擴增,若需長期保存須放置-80 ℃冰箱,但應避免反復凍融)。

1.3.2 熒光PCR擴增(使用B盒)

1)從試劑盒中取出熒光PCR反應液、Taq酶,室溫融化后,2 000 r/min離心5秒。設所需PCR管數為nn = 樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照),每個測試反應體系需要20 μL 熒光PCR反應液和0.5 μL Taq酶。計算好各試劑的使用量,加入一適當體積小管中,充分混合均勻后,向每個PCR管中各分裝20 μL。

2)分別向上述PCR管中加入1.3.111)中制備的DNA溶液各5μL,蓋緊管蓋,500 r/min 離心30秒。

3)將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內,作好標記。反應參數設置:

階段,預變性95/3分鐘

第二階段,95/15秒,52/10秒,60/35秒共45個循環。熒光收集在第二階段每次循環的60℃延伸時進行。

2 判定

2.1 結果分析條件的設定

閾值設定原則:根據儀器噪聲情況進行調整,以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的高點為準。對于多通道熒光PCR儀,選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結果,ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團。

2.2 質控標準

2.2.1 陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。

2.2.2 陽性對照的Ct值應小于等于28,并出現典型的擴增曲線。

2.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件,此次實驗視為無效。

2.3 結果判定

2.3.1 陰性:無Ct值,且無特征性擴增曲線,表明樣品為陰性。

2.3.2 陽性:Ct值≤38.0,且出現典型的擴增曲線,表示樣品為陽性。

2.3.3 Ct值大于38.0,且出現典型的擴增曲線的樣品建議復驗。復驗仍出現上述結果的,判為陽性,否則判為陰性。

【注意事項】

1 實驗室應至少分三個區:樣品處理區、反應混合物配制區和檢測區。

2 各區物品均為,不得交叉使用,避免污染。檢測結束后,應立即對工作臺進行清潔。

3 Buffer A有很強的腐蝕性,切勿沾到皮膚或衣服上,否則應立即用大量清水沖洗并擦干。

4 在整個檢測過程中應注意避免交叉污染:提取核酸時應用滅菌的鑷子夾取離心管;對離心管開蓋時應避免粘在手上或濺出,否則要立即更換手套。

5 反應液在使用前要*融化,并將反應液與Taq酶瞬時離心將液體甩至管底。分裝反應液時,應盡量避免產生氣泡。上機前注意檢查各反應管是否蓋緊,以免熒光物質泄露污染儀器。

6 陽性對照在吸取前應在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩12秒。

7 試劑盒中各組分應避免反復凍融。

8 對樣品及其廢棄物的操作應嚴格遵守生物安全規定。

9 本試劑盒僅供獸醫及相關專業人士使用。

【貯藏與有效期】  非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒的A盒室溫保存,B盒在-20℃保存,有效期為12個月。

【規格】  48檢測/

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